本文是一篇水稻的蛋白質組學文章，作者希望通過比較富硒和非富硒水稻的蛋白表達差異研究關鍵的基因與通路。
這項工作被指定為使用相對和絕對定量（iTRAQ）蛋白質組學方法的等壓標簽研究天然富硒和非富硒水稻中蛋白質差異表達的方法。提取的蛋白質經過酶消化，脫鹽，并通過iTRAQ結合液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術進行鑒定。進行高pHC18分離分析，然后通過ProteinPilotTM（V4.5）搜索引擎分析數據。通過比較相對定量的蛋白質來搜索蛋白質差異表達。使用基因本體論（GO），直系同源蛋白質簇（COG）和《京都議定書》的基因和基因組百科全書（KEGG）代謝途徑進行了分析�？偣矙z測到3235個蛋白質，定量了3161個蛋白質，其中401個是差異蛋白質。揭示了208個下調蛋白和193個上調蛋白。篩選出77個靶向的顯著差異表達蛋白進行進一步分析，并將其分為10類：氧化還原酶，轉移酶，異構酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白。結果表明，天然富硒稻的抗逆，抗氧化，活性氧代謝，碳水化合物和氨基酸代謝均高于非硒稻。發(fā)現在非富硒水稻中淀粉合成途徑的激活是豐富的。半胱氨酸合酶（CYS）和甲基轉移酶（metE）可能是引起氨基酸差異的兩個關鍵蛋白。OsAPx02，CatC，riPHGPX，HSP70和HSP90可能是調節(jié)兩種水稻抗氧化和抗應激作用差異的關鍵酶。這項研究提供了有關富硒和非富硒水稻中蛋白質機制和次生代謝產物偏差的基本信息。
前言
硒對植物的生長發(fā)育有許多影響。它調節(jié)光合作用，呼吸作用，增強抗逆性并減輕自由基的破壞，同時還減輕了重金屬的毒性作用。世界上約有一半人口食用大米（OryzasativaL.）作為主食。因此，通過育種使其生物強化是一個長期且相對無風險的過程。水稻基因組的測序和研究比其他農作物更多。此外，水稻中富硒的分子機制尚不清楚。
用于相對定量和絕對定量（iTRAQ）技術的等壓標記是一種通過串聯質譜法在定量蛋白質組學中用于確定來自不同來源的蛋白質量的等壓標記方法。它使用穩(wěn)定的同位素標記分子對樣品蛋白質或肽片段進行準確的定性鑒定和定量分析。它可以對不同樣品中蛋白質的絕對或相對含量進行比較，以鑒定差異蛋白質和功能。
在該實驗中，使用iTRAQ蛋白質組學方法研究了蛋白質和代謝組水平下富硒和富硒天然水稻中蛋白質的差異表達�；虮倔w論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝途徑用于分析與水稻生物學相關的差異蛋白譜和信號傳導途徑。這些蛋白質的功能注釋和表征將提供基本信息，并有助于詳細研究硒反應機制。通過生物信息學分析和驗證所確定的信號通路，將為進一步研究富硒水稻的抗氧化和抗衰老機制提供基礎。
方法
蛋白質鑒定與生物信息學分析
采用了基于質譜的蛋白質組學鑒定的基本過程。通過系列優(yōu)化液相色譜-串聯質譜數據，然后將其與數據庫進行比較以對蛋白質評分以進行蛋白質鑒定。使用ProteinpilotTMV4.5在水稻轉錄組數據庫中搜索肽段的MS/MS數據。獨特肽段顯示蛋白質組獨特肽段序列的數量。僅考慮具有至少一個獨特肽且未使用值大于1.3的蛋白質進行進一步分析，并對其進行t檢驗。當差異為1.5倍或更大時（即，上調≥1.5，下調≤0.67），則被視為差異顯著的蛋白質（p值≤0.05）。注釋功能用于執(zhí)行差異蛋白的基因功能聚類（GO分析）。京都百科全書的基因和基因組途徑數據庫用于分析涉及差異蛋白的代謝途徑。所識別蛋白質的物理，化學性質和分布用Excel圖形表示。
結果
質譜鑒定結果
通過ProteinpilotTM軟件（V4.5，Boston，MA，USA）在水稻轉錄組數據庫中搜索質譜數據。鑒定出3235種蛋白質的總譜，報告可信度超過95％。其中，定量了3161種蛋白質，進一步由401種差異表達蛋白質組成。特異顯著差異表達蛋白質分析揭示了富硒水稻中大量下調的修飾蛋白質（208個）和非硒水稻中大量上調的修飾蛋白質（193個）。蛋白質的分子量范圍為8.2kDa至611.3kDa，等電點范圍為3.18至12.77，疏水性范圍為-2.01至1.29，如圖1所示。當疏水性數據>0時，越大值，親水性越強。相比之下，當數據＜0時，發(fā)現該值越小，疏水作用越強。（注：定量的蛋白質數量、分子量范圍、等電點范圍和疏水性范圍等基本信息）
對鑒定出的蛋白質進行GO，KEGG和COG注釋，以全面反映這些蛋白質在各種生命活動中的生物學功能和意義。從富硒和非富硒水稻中獲得的所有蛋白質的功能注釋顯示總共3235種差異蛋白質。其中，3122種蛋白質被細分為53種具有層次結構的GO分類（圖2）。COG分類發(fā)現R類（僅用于一般功能預測）顯著富集并包含452種蛋白質（圖2和3）。通過KEGG鑒定出的差異代謝途徑中有1599種蛋白質被細分為116種分類（圖2）。（將篩選出的差異蛋白在GO、KEGG和COG進行功能注釋）
基因本體是一種全面的方法，它可以指示生物中基因和基因產物的特性。為了得到詳細的描述，GO被進一步分為三個組成部分。例如，生物過程，細胞成分和分子功能。富硒和非富硒水稻之間的生物過程相關GO術語揭示了401個差異表達的蛋白質，主要參與28種不同功能。富硒和非富硒水稻的GO差異分析表明，與上調基因相比，下調基因的數量更多。
直系同源蛋白質簇是用于直系同源蛋白質分類的數據庫。我們將識別出的差異蛋白與COG數據庫進行了比較，以預測這些蛋白的可能功能，然后對其進行功能分類統(tǒng)計（圖3）。排在前5位的COG類別最高的是：R，O，J，G和C。推論每個類別的功能是：一般功能預測（16.91％）；蛋白質轉化，翻譯修飾，伴侶蛋白（12.76％）;參與翻譯，核糖體結構和生物發(fā)生（8.8％）；碳水化合物運輸和代謝（8.7％）；以及能源的產生和轉化（8％）。結果表明，差異表達的蛋白質參與翻譯后修飾，碳水化合物和核糖體運輸。他們還在某種程度上參與了能量生產和氨基酸運輸。
不同的蛋白質在體內彼此協(xié)調以表達其生物學行為。因此，基于途徑的注釋拓寬了對其生物學功能的進一步了解。KEGG是一個主要的公共途徑相關數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）。途徑分析可以確定蛋白質調節(jié)的重要生化途徑，代謝途徑和信號傳導途徑。KEGG數據庫的結果表明，差異蛋白總共參與了90條信號通路（表4）。前10個代謝途徑是淀粉和蔗糖代謝途徑（9.03％），糖酵解和糖異生途徑（9.03％），內質網蛋白加工途徑（6.94％），核糖體代謝（6.6％），光合生物炭固定途徑（5.21％），果糖和甘露糖代謝（4.86％），半乳糖代謝（4.17％），氨基酸，核苷酸葡萄糖代謝（4.17％），嘌呤代謝（4.17％）和丙酮酸代謝（4.17％）。表4給出了表達的蛋白質數量和途徑ID。
正如GO所披露的，某些途徑的上調和下調的DEP之間的差異令人著迷，如圖5所示。發(fā)現諸如“細胞外區(qū)域部分”，“病毒繁殖”和“核酸結合轉錄因子活性”等途徑僅在非富硒水稻中表達。硒反應性差異表達蛋白主要與多種細胞功能有關，這些功能與細胞過程，細胞和細胞部分的主要成分，離子結合和催化活性有關（圖5）。
可以在圖6中看到標注到S727和S3057的前10個DEP的KEGG功能途徑統(tǒng)計餅圖。從結果可以看出，富硒和不富硒的前10個功能途徑的表達是不同的白飯。從GO，KEGG注釋分析可以明顯看出，代謝途徑是401種差異蛋白中含量最高的途徑。盡管在兩個水稻組中最常見的途徑是代謝途徑，但富含硒的水稻（73％）中該途徑并發(fā)的趨勢似乎最為明顯。在前10條帶注釋的途徑中有6種相同的功能，但是在兩種水稻類型中，這些途徑富硒和非富硒大米分別占比是不同的。水稻中對硒有響應的DEPs的表達更多。因此，富硒水稻似乎比非富硒水稻具有更好的分子功能和調控作用。
最后，根據表達水平，分子功能和代謝途徑篩選出77種靶向差異蛋白（圖7）。根據它們作為氧化還原酶，轉移酶，異構酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白的功能將它們進一步分類。每個類別的比較表明，對于大多數類別，富硒水稻中表達的蛋白質數量更多。非富硒水稻中水解酶和連接酶的蛋白質數量更多。兩種水稻中表達的裂解酶功能蛋白相同。
富硒和非富硒水稻的比較注釋分析結果表明，蛋白質組表達水平存在顯著差異。一系列生物信息學分析指出了401種差異蛋白的存在。其中77種靶向差異蛋白根據其功能分為10組：氧化還原酶，轉移酶，異構酶，熱休克蛋白，裂解酶，水解酶，連接酶，合成酶，微管蛋白和肌動蛋白。表5中進一步討論了功能分布。
這項研究為不同水稻基因型之間的次生代謝差異提供了基礎數據，并在蛋白質水平上發(fā)現了重要信息，可用于進一步研究富硒食品。
基于iTRAQ技術對水稻進行了定量蛋白質組學研究，以發(fā)現蛋白質組差異表達水平上天然富硒水稻和非富硒水稻之間的差異。差異蛋白質的生物信息學分析表明，天然富硒水稻的抗應激，抗氧化，活性氧代謝，碳水化合物和氨基酸代謝均優(yōu)于非富硒水稻。但是，在非富硒水稻中淀粉合成途徑明顯更多。這項研究為富硒和非富硒水稻中的蛋白質組分析和蛋白質差異表達提供了有趣的見解。在自然界中，硒是許多生物和代謝過程的主要貢獻者，并具有清除作用。然而，目前的研究培育了我們對該微量元素功能的理解，并揭示了硒的蛋白質機制。
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日期:2021/11/20 點擊:918 文章來源:安徽硒無憂現代農業(yè)科技有限公司
導讀:種植富硒水稻使用安徽硒無憂富硒肥，水稻專用的富硒葉面肥
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